电喷雾电离 ( ESI ), 基质辅助雷射解吸电离( MALDI） 技术, 和飞行时间质量分析器的出现为分析合成高分子提供了良好的工具。1988 年,Tanaka 等人 率先报导以含有金属微粒的甘油为基质测定了分子量高达 22,00Da 的聚乙二 醇( PEG ) 的分子量分布, 接着,Dains 等人 报导用标準的 MALDI 样品製备方法测定工业高分子聚丙烯酸和聚苯乙烯磺酸, 后者分子量在30000 Da 以上 ; 基质辅助雷射解吸离子化技术的发明者 Karas M.和 Hillenkamp F.于 1992年报导 用 MALDI一TOF 测定聚苯乙烯分子量达 70KDa,PEG 分子量达 40 KDa, 其结果 与GPC 方法基本一致,经过短短几年的发展, 直至1996 年为止, 对 PS 的可测分子量上限已达1500 KDa 。

基于MALDI-TOF生物质谱的组织成像技术 （MALDI-imaging mass spectrometry ，MALDI-IMS）是一门新兴的分子成像技术，对于发现疾病生物标誌物和研究药物代谢等方面具有重要意义，并具有良好的临床套用前景。MALDI-TOF-MS近期的发展主要在改善灵敏度，提高解析度，扩大套用範围以及标誌物的鉴定等方面。灵敏度和解析度主要受雷射器频率和能量，样本切片质量，基质喷涂效果等因素影响。高频率（200Hz和1000Hz）的固体雷射器已经普遍用于MALDI质谱中，可在较短时间内完成一个切片的成像质谱数据採集，但可调光束直径的雷射器对于IMS更有利。切片质量和基质覆盖一直是IMS的一个技术瓶颈.近年来,一些研究者和质谱公司开发了新型基质喷涂设备和技术,改善了切片前处理方法,大大提高了质谱成像技术的灵敏度和解析度。

仪器（如图1）主要由两部分组成基质辅助雷射解吸电离离子源（MALDI）和飞行时间质量分析器（TOF）。MALDI的原理是用雷射照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从雷射中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程。它是一种软电离技术，适用于混合物及生物大分子的测定。TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比（M/Z）与离子的飞行时间成正比 ，检测离子。MALDI-TOF-MS具有灵敏度高、準确度高及解析度高等特点，为生命科学等领域提供了一种强有力的分析测试手段，并正扮演着越来越重要的作用。

图1 MALDI-TOF MS仪器结构框图

早期的MALDI一TOF 儘管能够分析质量数达数万的大分子, 它只有数百的解析度,质谱峰较宽,信噪 比不理想, 质量测量精度不高。对于 MALDI一TOF, 影响解析度的主要因素是初始离子的动能分散。 这已在 Chait 等人的实验中得到证实 。目前主要有两个措施来解决这个问 题: ① 静电反射器 ( ElectrostaticReflec tron), 这个概念最早由 Manlyrin 于 1973 年提出,其基本原理是当离子源飞向反射器时.高动能的离子会比低动能的离子更深的穿入反射器。 离子被反射后, 飞抵离子检测器, 高动能的离子飞行的路程就长一 些。 调节反射器条件就可以使得质量相同而初始动能不同的离子更加一致地达到检测器, 实现动能的一级聚焦。Mamyrin于 1994 年 又提出了对离子进行高次聚集的设计方案。Cotetr 用十分简 单的圆筒电极作为反射器实现了 Mamyrin 的构想 。反射器可以使MALDI 一TOF 的解析度大大提高。②离子延迟引出 ( Delay Extraction) , 当雷射照射靶的瞬间, 若靶电极和与其相对的离子引出电极处于相同的电位, 即在两电极之间形成无场区, 那幺被解吸离子以不同的初始速度在无场区内运动, 经过一 段延迟时间后, 速度高的离子离靶远,速度低的离子离靶近, 然后以脉冲方式在瞬间使靶与引出电极处于不同电位, 由此产生的电场把离子引出, 经聚焦透镜后飞出离子源。 离靶近的离子比离靶远的离子得到更大的加速 ( 因而获得更大的动能 ), 适当选择延迟时间及靶与引出电极间电压差, 可以有效地补偿离子的初始动能分散, 从而显着地提高线性 TOF 质谱仪的解析度, 飞行距离约 1 m 的线性TOF质谱仪的解析度可达 2000-3000。 这一技术即为 “延迟引出” （Delay Extraction) 技术或称为“ 脉冲离子引出”( PulseIon Extraction, PIE )。 延迟引出技术与离子反射器联合用可使 MALDI一TOF 质谱仪的解析度超过一 万。

对于基质 、溶剂、 盐 ( 金属离子 ) 和样品製备方法的选择是 MALDI 分析高聚物成败的关键因素。 最最佳化的条件是使样品分子和基质均匀地形成共结晶, 在分析合成高分子时, 要达到这个目的并不容易。

MALDI方法分析大分子, 重要的关键之一是选择合适的基质。结果表明, 效果较佳的基质只有几种 。

水溶性合成高分子如聚乙二醇 ( PEG） 、聚丙二醇经常出现于早期的 MALDI 研究中, 这是因为分析多肽的基质也可以套用于它们, 对于一些高分子, 可以从高分子和基质的溶解性中找到一些选择基质的思路。, 选择基质时应使基质与高分子的极性比较一致, 彼此之间具有兼容性。 , 选择最佳基质仍然是一个尝 试的过程。

与 MALDI 分析生物分子相比,合成高分子的离子化在多数情况下是金属离子阳离子化而不是质子化。 , 仅仅最佳化基质是不够的。 而应该与金属离子考虑。 对于相对于极性较大的高分子, 在 MALDI 分析中一般 是钾离子化或钠离子化。

使用一个特定的样品製备方法时, 必须先选择适用于基质、 样品 和阳离子化盐的溶剂。 最理想的情况是使用一种溶剂。 这样可以减少样品在靶上结晶时分层的危险。 , 盐类几乎不溶于用于非极性合成高分子的有机溶剂。 一般来讲, 盐可以先溶于一个中间溶剂如丙醇中, 然后再用于基质和样品的溶剂稀释。 製备样品时, 应选择适当的溶剂、合适的浓度及配比, 才能获得较好的结果。

分子量是有机化合物最基本的理化性质参数【35】。分子量正确与否往往代表着所测定的有机化合物及生物大分子的结构正确与否。MALDI-TOF是一种软电离技术，不产生或产生较少的碎片离子。它可直接套用于混合物的分析，也可用来检测样品中是否含有杂质及杂质的分子量。分子量也是生物大分子如多肽、蛋白质等鉴定中首要的参数，也是基因工程产品报批的重要数据之一。MALDI-TOF的準确度高达0.1%~0.01%，远远高于目前常规套用的SDS电泳与高效凝胶色谱技术，目前可测定生物大分子的分子量高达600KDa。

图2 MALDI-TOF法与GPC法所测分子量比较

蛋白质组学是当前生命科学研究的前沿领域。对蛋白质快速、準确的鉴定是蛋白质组学研究中必不可少的关键性的一步。採用MALDI-TOF-MS测得肽质量指纹谱（PMF）在资料库中查询识别的方式鉴定蛋白质，是目前蛋白质组学研究中最普遍套用的最主要的鉴定方法。肽质量指纹谱（Peptide Mass Fingerprinting, PMF）是蛋白质被识别特异酶切位点的蛋白酶水解后得到的肽片段的质量图谱。由于每种蛋白的胺基酸序列（一级结构）都不同，当蛋白被水解后，产生的肽片段序列也各不相同，其肽质量指纹图也具有特徵性。MALDI-TOF-MS分析肽混合物时，能耐受适量的缓冲剂、盐，而且各个肽片几乎都只产生单电荷离子，MALDI-TOF成为进行分析PMF的首选方法。在我们关于蛋白质组学研究的实际工作中，几乎所有的发现均是从这一步开始做起来的！

图3 PS2，800的MALDI-TOF质谱图

由于PMF鉴定结果的可靠性受诸多因素影响，使得部分鉴定结果往往不是十分明确，特异性不高。多肽胺基酸序列匹配被认为是特异性最好的鉴定方法。在蛋白质组学研究中，利用质谱测序一般採用两种方式一种是利用串联质谱（MS/MS）测序；另一种是利用源后衰变（post-source decay，PSD）技术测序。

在反射式MALDI-TOF-MS中，当脉冲雷射照射到微量样品与饱和小分子基质混合形成的共结晶上时，能量通过基质传递给样品，导致样品被解析电离，电离后形成的亚稳分子离子在飞经无场区（即飞行管区）时发生裂解（其活化能来自在离子源与基体发生的碰撞，在无场区与残留气体的碰撞，雷射辐射及各种热机制等）所产生的子离子（即源后分解碎片离子），可以通过不断改变反射器电压来进行分离、收集并记录于检测器，形成能为多肽和蛋白质一级结构提供十分丰富而有效的结构信息的PSD质谱图。利用PSD谱图，结合资料库检索可以迅速、高特异性地鉴定蛋白质。

目前，在蛋白质组学研究中，部分经2DE分离的蛋白质样品无法通过PMF鉴定或鉴定结果不明确，可将PSD测序功能套用于这些蛋白质的鉴定。随着对PSD技术的不断研究和发展，尤其是结合MALDI-TOF-MS本身所具有的高灵敏度、高通量、样品靶点可多次套用测定、分析时主要产生单电荷準分子离子以及能够耐受一定量的盐和干扰物等特点，PSD-MALDI-TOF-MS将会在蛋白质组学、代谢组学以及药物筛选的研究中发挥更大的作用。

随着分子生物学技术和反义核酸药物技术的发展，越来越多的寡核苷酸片段被合成，用以作引物、探针以及反义药物等。对这些片段进行快速检测，以判断合成的是否完全及合成的序列是否正确，是完全必要的。包括MALDI-TOF-MS在内的生物质谱是迄今为止进行这种检测最好的手段。用MALDI-TOF-MS测定分析寡核苷酸，简单、快速、準确、灵敏。结合3’—外切酶和5’—外切酶可以对寡核苷酸全序列进行测定。