实时萤光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点
基本内容
实时萤光定量PCR 实时萤光定量PCR技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛套用。本文试就其定量原理、方法及参照问题作一介绍。
原理
所谓实时萤光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入萤光基团，利用萤光信号积累实时监测整个PCR进程，通过标準曲线对未知模板进行定量分析的方法。
在萤光定量PCR技术中，有一个很重要的概念--Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是每个反应管内的萤光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图1所示）。
PCR反应的前15个循环的萤光信号作为萤光本底信号，萤光域值的预设设定是3-15个循环的萤光信号的标準偏差的10倍，即threshold=10′SDcycle6-15
研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存线上性关係〔1〕，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标準品可作出标準曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值（如图2所示）。，只要获得未知样品的Ct值，即可从标準曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
萤光定量PCR所使用的萤光化学可分为两种萤光探针和萤光染料。现将其原理简述如下
1）TaqMan萤光探针PCR扩增时在加入一对引物的加入一个特异性的萤光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告萤光基团和一个淬灭萤光基团。探针完整时，报告基团发射的萤光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告萤光基团和淬灭萤光基团分离，从而萤光监测系统可接收到萤光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个萤光分子形成，实现了萤光信号的累积与PCR产物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。
2）SYBR萤光染料在PCR反应体系中，加入过量SYBR萤光染料，SYBR萤光染料特异性地掺入DNA双链后，发射萤光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何萤光信号，从而保证萤光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
在萤光定量PCR技术中，有一个很重要的概念--Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是每个反应管内的萤光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图1所示）。
PCR反应的前15个循环的萤光信号作为萤光本底信号，萤光域值的预设设定是3-15个循环的萤光信号的标準偏差的10倍，即threshold=10′SDcycle6-15
研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存线上性关係〔1〕，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标準品可作出标準曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值（如图2所示）。，只要获得未知样品的Ct值，即可从标準曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
萤光定量PCR所使用的萤光化学可分为两种萤光探针和萤光染料。现将其原理简述如下
1）TaqMan萤光探针PCR扩增时在加入一对引物的加入一个特异性的萤光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告萤光基团和一个淬灭萤光基团。探针完整时，报告基团发射的萤光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告萤光基团和淬灭萤光基团分离，从而萤光监测系统可接收到萤光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个萤光分子形成，实现了萤光信号的累积与PCR产物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。
2）SYBR萤光染料在PCR反应体系中，加入过量SYBR萤光染料，SYBR萤光染料特异性地掺入DNA双链后，发射萤光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何萤光信号，从而保证萤光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
意义
1．几种传统定量PCR方法简介
1）内参照法在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引物用萤光标记，下游引物不标记。在模板扩增的，内标也被扩增。在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其萤光强度，以内标为对照定量待检测模板。
2）竞争法选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物扩增（其中一个引物为萤光标记）。扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定萤光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。
3）PCR－ELISA法利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗地高辛或生物素酶标抗体－辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显色。常规的PCR－ELISA法只是定性实验，若加入内标，作出标準曲线，也可实现定量检测目的。
2．内标在传统定量中的作用由于传统定量方法都是终点检测，即PCR到达平台期后进行检测，而PCR经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。同一个模板在96孔PCR仪上做96次重複实验，所得结果有很大差异（见图4），无法直接从终点产物量推算出起始模板量。加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不準确性。但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。
1）内参照法在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引物用萤光标记，下游引物不标记。在模板扩增的，内标也被扩增。在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其萤光强度，以内标为对照定量待检测模板。
2）竞争法选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物扩增（其中一个引物为萤光标记）。扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定萤光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。
3）PCR－ELISA法利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗地高辛或生物素酶标抗体－辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显色。常规的PCR－ELISA法只是定性实验，若加入内标，作出标準曲线，也可实现定量检测目的。
2．内标在传统定量中的作用由于传统定量方法都是终点检测，即PCR到达平台期后进行检测，而PCR经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。同一个模板在96孔PCR仪上做96次重複实验，所得结果有很大差异（见图4），无法直接从终点产物量推算出起始模板量。加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不準确性。但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。
影响
1．实时萤光定量PCR无需内标实时萤光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次萤光信号的强度，并记录在电脑软体之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标準曲线获得定量结果。，实时萤光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的
1）Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，Ct值的重现性极好，即同一模板不间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恆定的。
2）Ct值与起始模板的线性关係由于Ct值与起始模板的对数存线上性关係，可利用标準曲线对未知样品进行定量测定，，实时萤光定量PCR是一种採用外标準曲线定量的方法。
2．内标对实时萤光定量PCR的影响
若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则PCR反应变为双重PCR，双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显着。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量的方法。
美国Texas大学的科研人员进行了外标法定量和内标法定量的方法学比较，得出的结论是内标法作为定量或半定量的手段是不可靠的，而外标準曲线的定量方法是一种準确的、值得信赖的科学方。
AppliedBiosystems公司的7700型实时萤光定量pcr仪是全球公认的萤光定量PCR的金标準，可实现多色萤光检测，但定量检测仍然採用外标準曲线的方法，而不用内标进行定量。
，利用外标準曲线的实时萤光定量PCR是迄今为止定量最準确，重现性最好的定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于基因表达研究、转基因研究，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。
萤光PCR是分子诊断的热点技术，它将先进的定量PCR与实时PCR技术相结合，西安天隆生产的国产实时萤光定量PCR仪为肝炎爱滋病等重大疾病的定量核酸检测及分子诊断、也为沙门氏菌阪崎氏肠桿菌等食品安全检测提供了先进手段。即使在已开发国家，萤光定量PCR仪和基因扩增仪都被广泛用于临床及生物学、医学研究。由于其极高的灵敏度、极宽的检测範围，以及精确定量、方便快速、无视窗期等优点，美国FDA及我国国家标準已将定量PCR仪规定为确诊禽流感等传染病以及奶粉等食品安全检测的必备仪器。
实时萤光定量PCR仪（real-timeQPCR）的发明实现了荣获诺贝尔化学奖的PCR核酸检测、分子诊断的技术飞跃。
1）Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，Ct值的重现性极好，即同一模板不间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恆定的。
2）Ct值与起始模板的线性关係由于Ct值与起始模板的对数存线上性关係，可利用标準曲线对未知样品进行定量测定，，实时萤光定量PCR是一种採用外标準曲线定量的方法。
2．内标对实时萤光定量PCR的影响
若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则PCR反应变为双重PCR，双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显着。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量的方法。
美国Texas大学的科研人员进行了外标法定量和内标法定量的方法学比较，得出的结论是内标法作为定量或半定量的手段是不可靠的，而外标準曲线的定量方法是一种準确的、值得信赖的科学方。
AppliedBiosystems公司的7700型实时萤光定量pcr仪是全球公认的萤光定量PCR的金标準，可实现多色萤光检测，但定量检测仍然採用外标準曲线的方法，而不用内标进行定量。
，利用外标準曲线的实时萤光定量PCR是迄今为止定量最準确，重现性最好的定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于基因表达研究、转基因研究，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。
萤光PCR是分子诊断的热点技术，它将先进的定量PCR与实时PCR技术相结合，西安天隆生产的国产实时萤光定量PCR仪为肝炎爱滋病等重大疾病的定量核酸检测及分子诊断、也为沙门氏菌阪崎氏肠桿菌等食品安全检测提供了先进手段。即使在已开发国家，萤光定量PCR仪和基因扩增仪都被广泛用于临床及生物学、医学研究。由于其极高的灵敏度、极宽的检测範围，以及精确定量、方便快速、无视窗期等优点，美国FDA及我国国家标準已将定量PCR仪规定为确诊禽流感等传染病以及奶粉等食品安全检测的必备仪器。
实时萤光定量PCR仪（real-timeQPCR）的发明实现了荣获诺贝尔化学奖的PCR核酸检测、分子诊断的技术飞跃。
优势
样品到达域值水平所经历的循环数称为Ct值（限制点的循环数）。域值应设定在使指数期的扩增效率为最大，这样可以获得最準确，可重複性的数据。如果扩增的还有标有相应浓度的标準品，线性回归分析将产生一条标準曲线，可以用来计算未知样品的浓度。
⑴病原体检测
目前，採用萤光定量PCR检测技术可以对淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人类乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、结核分枝桿菌、EB病毒和巨细胞病毒等病原体进行定量测定。与传统的检测方法相比具有灵敏度高、取样少、快速简便等优点。如结核菌基因诊断的意义主要表现在
1.区分TB与其它分枝桿菌；
3.检测TB耐药基因；
2.提高TB的阳性检出率。
⑵产前诊断
到目前为止，人们对遗传性物质改变引起的遗传性疾病还无法治疗，只能通过产前监测，减少病婴出生，以防止各类遗传性疾病的发生，如为减少X连锁遗传病患儿的出生，从孕妇的外周血中分离胎儿DNA，用实时萤光定量PCR检测其Y性别决定区基因是一种无创伤性的方法，易为孕妇所接受。
⑶药物疗效考核
对B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)定量分析显示病毒量与某些药物的疗效关係。HCV高水平表达，干扰素治疗作用不敏感，而HCV低滴度，干扰素作用敏感；在拉米夫定治疗过程中，HBV-DNA的血清含量曾有下降，随后若再度上升或超出以前水平，则提示病毒发生变异。如PCR技术在HBV检测中的套用及意义
1.了解B肝病毒在体记忆体在的数量。
2.是否複製。
3.是否传染，传染性有多强。
4.是否有必要服药。
5.肝功能异常改变是否由病毒引起。
6.判断病人是适合用哪类抗病毒药物。
7.判断药物治疗的疗效。
⑷肿瘤基因检测
儘管肿瘤发病的机理尚未清楚，但相关基因发生突变是致癌性转变的根本原因已被广泛接受。癌基因的表达增加和突变，在许多肿瘤早期就可以出现。实时萤光定量PCR不但能有效地检测到基因的突变，而且可以準确检测癌基因的表达量。目前用此方法进行过端粒酶hTERT基因、慢性粒细胞性白血病WT1基因、肿瘤ER基因、前列腺癌PSM基因、肿瘤相关的病毒基因等多种基因的表达检测。随着与肿瘤相关的新基因的不断发现，萤光定量PCR技术将会在肿瘤的研究中发挥更大的作用。
⑴病原体检测
目前，採用萤光定量PCR检测技术可以对淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人类乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、结核分枝桿菌、EB病毒和巨细胞病毒等病原体进行定量测定。与传统的检测方法相比具有灵敏度高、取样少、快速简便等优点。如结核菌基因诊断的意义主要表现在
1.区分TB与其它分枝桿菌；
3.检测TB耐药基因；
2.提高TB的阳性检出率。
⑵产前诊断
到目前为止，人们对遗传性物质改变引起的遗传性疾病还无法治疗，只能通过产前监测，减少病婴出生，以防止各类遗传性疾病的发生，如为减少X连锁遗传病患儿的出生，从孕妇的外周血中分离胎儿DNA，用实时萤光定量PCR检测其Y性别决定区基因是一种无创伤性的方法，易为孕妇所接受。
⑶药物疗效考核
对B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)定量分析显示病毒量与某些药物的疗效关係。HCV高水平表达，干扰素治疗作用不敏感，而HCV低滴度，干扰素作用敏感；在拉米夫定治疗过程中，HBV-DNA的血清含量曾有下降，随后若再度上升或超出以前水平，则提示病毒发生变异。如PCR技术在HBV检测中的套用及意义
1.了解B肝病毒在体记忆体在的数量。
2.是否複製。
3.是否传染，传染性有多强。
4.是否有必要服药。
5.肝功能异常改变是否由病毒引起。
6.判断病人是适合用哪类抗病毒药物。
7.判断药物治疗的疗效。
⑷肿瘤基因检测
儘管肿瘤发病的机理尚未清楚，但相关基因发生突变是致癌性转变的根本原因已被广泛接受。癌基因的表达增加和突变，在许多肿瘤早期就可以出现。实时萤光定量PCR不但能有效地检测到基因的突变，而且可以準确检测癌基因的表达量。目前用此方法进行过端粒酶hTERT基因、慢性粒细胞性白血病WT1基因、肿瘤ER基因、前列腺癌PSM基因、肿瘤相关的病毒基因等多种基因的表达检测。随着与肿瘤相关的新基因的不断发现，萤光定量PCR技术将会在肿瘤的研究中发挥更大的作用。