维甲酸对人子宫颈癌细胞系HeLa细胞间隙连接蛋白转导途径调控作用
一、材料来源
1、细胞系：HeLa细胞由第四军医大学动物实验中民提供。
2、主要试剂：10%热灭活小牛血清及RPMI-1640培养基为美国Gibco公司产品;全反式维甲酸购自美国Sigma公司;特异性钙指示剂(Fluo-3 AM,测钙荧光探针)购自美国Bio-Rad公司;D-Hank\'2缓冲液为本室配制;鼠抗Cx43单克隆抗体购自美国Zymed公司;荧光素标记的羊抗鼠IgG购自美国Jackson公司;直流蛋白分析试剂盒、蛋白电转移装置购自美国Bio-Rad公司;硝酸纤维素膜购自美国Hybond公司;抗酪氨磷酸化特异性抗体4G10购自美国CA公司;增强化学发光检测试剂盒购自英国Aemrsham International Plc分司。
3、主要仪器：激光扫描聚焦显微镜系统MRC-1024型系美国Bio-Rad公司;流式细胞仪CS-PROFILE II型系美国Coulter分司产品。
二、方法
1、细胞培养及分化诱导：接种相同浓度的HeLa细胞，培养于含10%执灭小牛血清的RPMI-1640培养基中，在细胞对数生长期加入全反式维甲酸，终浓度分别为1X10-2mol/L、1X10-3mol/L、1X10-4mol/L，间隔24h后按原浓度换液。逐日进行细胞记数。
2、细胞内游钙浓度[Ca2 ]i测定：离心后收集HeLa细胞，用100nmol/L的Fluo-3 AM于37℃时与HeLa细胞结合90min，D-Hank\'s缓冲液充分洗涤去除细胞外未结合Fluo-3 AM的景，滴加结合Fluo-3 AM的活细胞于检测盒中立即进行激光扫描共聚焦显微镜技术检测。采集到清晰的细胞内游离钙分布直观图像，利用其图像量化、分析系统进行细胞质内游离钙的定位、以及[Ca2+]i的定量分析。测得的荧光强度经校准后通过以下公式即可求得[Ca2+]i。[Ca2+
]i为kdx(F-Fmin)/(Fmax-F)。其中，kd为X(F-Fmin)(Fmax-F)。其中，kd为Fluo-3 AM的解离常数400nmol/L,F为荧光强度，Fmax为最大荧光强度，Fmin为最小荧光强度。
3、流式细胞仪分析：取维甲酸处理后的HeLa细胞及对照HeLa细胞制成单制细胞悬液，加入鼠抗Cx43单克隆抗体(1：1000)，设无关鼠抗IgG代替一抗作为特异性对照，于4℃作用30-60min。离心后收集细胞，用0.01 mol/L磷酸缓冲液洗涤并悬浮，加入荧光素标记的羊抗鼠IgG(1：40)，4℃反应30-45min，磷酸缓冲液洗涤并悬浮后，于流式细胞仪上于488nm激发波长时测定阳性荧光染色显示基因表达产物，采用美国Phoenix计算机软件Multicycle下进行结果分析。
4、Cx43表达量及其酷氨酸化检测：收集每组约51x105个HeLa细胞;提取细胞全蛋白，用直流蛋白分析试剂盒和分光光度计绘制曲线并测定蛋白浓度。每孔取20μg蛋白，加上样缓冲液100煮沸变形4min,80V电泳30min，使蛋白电泳至浓缩胶和分离交界处;120V电泳1h至分离胶底部，蛋白电泳装置完成，10%十二烷基硫酸钠-聚丙酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，用蛋白电转移100V 350mA 1h将蛋白转移至硝酸纤维素膜上。1%人蛋白逆转录封闭1-2h，分别与鼠抗Cx43单克隆抗体(1：2000)、抗酷氨酸磷酸化特异性抗体4G10(1：32)逆转录孵育1h，硼酸缓冲液充分洗涤，增强化学发光检测试剂盒放射自显影于X线胶片上。
三、统计学方法 采用美国Phoenix公司的Multicycle软件进行。
结果
一、细胞质内[Ca2 ]i的检测
经维甲酸处理的HeLa细胞，在静息状态下的细胞内第2信使--[Ca2 ]i的较未经维甲酸处理的HeLa细胞内显著增加，细胞质内Fluo-3AM弥散分布，其红色荧光物分布较广泛，荧光强度明显增强。见图1，2。维甲酸处理前后的HeLa细胞中静息状态下[Ca2 ]i分别为35.73nmol/L58.16nmol/L,两者比较，差异有显著性(P<0.05)。
二、Cx43表达量的检测
流式细胞仪检测HeLa细胞经维甲酸作用后，Cx43表达量有所增加，阳性荧光强度明显增强，Cx43阳性细胞表达率由维甲酸作用前的1.9%上升至26.3%。提取HeLa细胞全蛋白，经SDS-PAGE电泳和蛋白印迹技分析，维甲酸处理前的HeLa细胞中Cx43表达较弱，而在维甲酸处理后的HeLa细胞中，Cx43表达明显增强。
三、Cx43酷氨酸磷酸化的检测
经抗酷氨酸磷酸化特异性抗体4G10蛋白印迹技术分析，维甲酸处理后的HeLa细胞所表达的Cx43在酪氨酸位点发生磷酸化作用，而维甲酸处理前的HeLa细胞无Cx43表达，更无酪氨酸磷酸化的出现(图4)。
讨论
一、维甲酸对HeLa细胞内[Ca2 ]i的影响
细胞内[Ca2 ]i的变化是机体生理功能所必需，不同种类细胞在静息状态下[Ca2 ]i有所不同。钙离子(Ca2 )为偶联细胞外刺激和细胞内反庆的第2信使，[Ca2 ]i的改变是该信使系调节细胞各种反应的关键，在细胞生理调控中发挥着重要作用，具有生物学活性的细胞内[Ca2 ]i的定量检测在细胞生理及病理中有重要的意义。许多疾病均伴随细胞内[Ca2 ]i的异常，尤其在肿瘤等病理状态下[Ca2 ]i的研究更为引人注目。本研究证实，[Ca2 ]i在静息状态下的HeLa细胞中(35.73nmol/L)与维甲酸处理后的HeLa细胞中(58.16nmol/L)相比显著降低，维甲酸处理后的HeLa细胞内被激发出明亮的钙荧光特质，未经处理的HeLa细胞内钙荧光特质明显减弱或呈阴性。[Ca2 ]i的降低与Cx43在HeLa细胞中的表达下降是相关的，也与各细胞的间隙连接通讯功能变化相一致。提示，[Ca2 ]i作为第2信使参加了HeLa细胞信号转导过程，其详细的作用机理有待进一步研究。
二、维甲酸对HeLa细胞Cx43酪氨酸磷酸化的作用
蛋白磷酸是调节蛋白质活性和功能的最重要、最基本、最普遍的可逆反应方式。蛋白酪氨酸磷酸化是指细胞内蛋白质在外界信号刺激下，分子中的酪氨酸磷酸化发生活性改变参与细胞内信号转导的蛋白将依次激活下游各级信号分子，最终发生生物学效应。研究发现，Cx基因在酪氨酸位点的可逆性磷酸化用，被认为是Cx基因最重要的表达调控方式，可使Cx基因作为功能结构单位，并维持Cx基因的数量和它所构成的间隙连接通道的正常功能，是细胞间隙连接通讯的快速调控的机理。
本实验中发现，HeLa细胞中Cx43表达不明显，更无酪氨酸磷酸化出现，HeLa经维甲酸处理后Cx43表达阳性，同时出现明显的酪氨酸磷酸化状态。目前，对Cx43起作用的蛋白激酶和磷酸化的酪氨酸残基仍未完全清楚。初步研究显示，外源信号如表皮生长因子、血小板衍生生长因子等可通过激活细胞相应的生长因子受体。使之出现激酶活性，诱发促分裂原活化蛋白激酶信号转导途径，启动复杂的信号转导级联反应，使细胞的Cx43发生酪氨酸磷酸化，Cx43可能是促分裂原活化蛋白激酶作用的底物，实现对细胞间隙连接通讯的调控。现已知Cx43发生酪氨酸磷酸化的调节，可能与第2信使(Ca2 、环腺苷酸)、蛋白激酶(促分理解原活化蛋白激酶、Ras癌基因-鸟苷三磷酸酶、原癌基因蛋白60蛋白激酶、蛋白激酶A、蛋白激酶C等等多种信号分子的参与有关。
由于Cx基因无明显的激酶活性，推测HeLa细胞中Cx43的酪氨酸磷酸化作用，可能是在各种外源性信号分子(如维甲酸)的作用下，通过激活各级酪氨酸激酶，引起信号转导途径中复杂的级联反应，导致效应分子Cx基因的酪氨酸残基发生磷酸化用，抑制细胞分裂增殖和恶性转化。